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Conociendo mejor a la toxina alfa

¿Por qué los científicos están investigando el papel de la toxina alfa en el desarrollo de la enteritis necrótica? Dos investigadores comparten sus puntos de vista sobre los estudios que podrían impactar el manejo de la enteritis necrótica, enfermedad grave y costosa.

Algunos estudios en los que se utilizó tanto un kit de prueba de la toxina alfa como la técnica de inmunohistoquímica, presentan sólida evidencia de que esta toxina desempeña un papel importante en el desarrollo de la enteritis necrótica, de acuerdo con lo dicho por la Dra. Joan Schrader en el Congreso Avícola Mundial.

La toxina alfa es una proteína tóxica que secreta la bacteria Clostridium perfringens y que también es un componente de Netvax, toxoide de C. perfringens tipo A, que cuenta con licencia condicionada en EE.UU. y que se administra a las reproductoras para controlar la enteritis necrótica en los pollos de engorde. Este biológico fue desarrollado por Intervet/ Schering-Plough Animal Health, explicó la Dra. Schrader, científica de la empresa.

El lanzamiento reciente de un kit diagnóstico comercial a base de tiras reactivas, diseñado para detectar C. perfringens y la toxina alfa en las heces, proporciona una nueva herramienta para evaluar el papel de la toxina alfa en el desarrollo de la enteritis necrótica, agregó. Esta investigadora también realizó pruebas de inmunohistoquímica para demostrar físicamente la presencia de la toxina alfa en el sitio de la lesión.

Para esta prueba se utilizan anticuerpos monoclonales adheridos a una tira de papel, tanto contra C. perfringens tipo A como contra su toxina alfa. Cuando la tira se expone a estos antígenos –presentes en las heces de pollo solubilizadas– se desarrolla una línea de color que demuestra la presencia de C. perfringens tipo A, y una segunda línea de color para la toxina alfa.

Detalles y resultados del estudio

Se utilizaron 52 pollos de engorde comerciales de un día de edad que se colocaron en el piso de los corrales de la unidad de investigación y desarrollo de la compañía en Elkhorn, Nebraska, EE.UU. Se alojaron 25 aves en un corral y el resto en otro, como testigos.

Se les administró un alimento iniciador no medicado durante los primeros 5 días, para luego cambiar a una dieta alta en proteína durante el resto del estudio. Cuando cumplieron 19, 20 y 21 días de edad, los animales experimentales recibieron un desafío con C. perfringens tipo A, por vía oral.

A los 23 días de edad se tomaron muestras fecales directamente de la cloaca de cada pollo y se analizaron de acuerdo con las instrucciones del kit diagnóstico. Cada muestra se analizó con tres tiras reactivas, aclaró la doctora.

También se asignaron calificaciones a sus lesiones de enteritis necrótica, que luego se utilizaron para determinar la prevalencia verdadera de esta enfermedad y la capacidad de las tiras reactivas de detectar a C. perfringens y a la toxina alfa, subrayó.

La prevalencia general de pruebas positivas a C. perfringens, según la calificación de lesiones, fue 33% para la calificación 0 (6/18), 18% para la calificación 1 (14/78), 19% para la calificación 2 (9/48), 61% para la calificación 3 (11/18) y 88% para la calificación 4 (16/18). La incidencia de tiras de prueba positivas a C. perfringens no fue diferente entre las aves positivas o negativas a enteritis necrótica (Cuadro 1), dijo Schrader.

Cuadro 1

Cuadro 1. La incidencia de resultados positivos con las tiras reactivas a C. perfringens no presentó diferencias entre las aves positivas o negativas a enteritis necrótica

CP = Clostridium perfringens Nota = Sólo se detectó la toxina alfa en los pollos positivos a enteritis necrótica
NA = No se analizó

Las tiras no detectaron la presencia de toxina alfa hasta que las calificaciones de lesiones llegaron a 3 ó 4: El kit fue capaz de detectar esta toxina en el 37% (7/18) de las pruebas entre los pollos con calificación 3 y en el 71% (13/18) de los pollos con calificación 4, señaló.

El estudio mostró una buena relación entre la calificación de lesiones y la detección de toxina alfa, toda vez que cuando la calificación era alta, aumentó la detección de la toxina con el kit analítico. Enfatizó la Dra. Schrader.

Además, el hallazgo de que las calificaciones de lesiones elevadas guardaban una relación positiva con los resultados de la tira reactiva para C. perfringens y toxina alfa en el sitio de las lesiones de enteritis necrótica, “respalda la hipótesis de que la severidad de las lesiones macroscópicas es directamente proporcional al número de C. perfringens presente y a la cantidad de toxina alfa producida”, concluyó.

Resultados de inmunohistoquímica

Posteriormente, la investigadora realizó pruebas de inmunohistoquímica sobre las lesiones de enteritis necrótica. Esta técnica se ha utilizado ampliamente para detectar la presencia de agentes patógenos en los tejidos. Para realizarla se utiliza un corte extremadamente delgado del tejido, que se fija a un portaobjetos de cristal, para observación al microscopio. Posteriormente se agrega a la preparación un anticuerpo teñido con fluoresceína, que se une al antígeno correspondiente, en caso de estar presente. En nuestro estudio “observamos una clara unión positiva de los anticuerpos”, explicó la doctora (véase la Figura 1).

Cuadro 1
Figura 1. El anticuerpo con pigmento fluorescente se une al antígeno en cuestión, en caso de estar presente.

Los resultados del presente estudio, dijo, “demuestran fehacientemente la participación de la toxina alfa en la enteritis necrótica”.

Aun cuando este kit de prueba fue de utilidad para los propósitos del estudio, aclaró, tal vez no sea particularmente aplicable en el campo para los productores que estén tratando de detectar la enteritis necrótica subclínica, que puede pasar inadvertida, pero de todas maneras afecta el rendimiento. La prueba sólo es capaz de diagnosticar los casos clínicos de la enfermedad, con calificaciones altas de lesiones, pero “para entonces, ya será evidente que las aves están enfermas”.

Un estudio en Estados Unidos sugiere que la toxina alfa desempeña un papel como causante de la enteritis necrótica

La vacunación del pollo de engorde con una toxina alfa recombinante los protegió contra el desafío experimental con Clostridium perfringens, sugiriendo que esta toxina desempeña un papel en la patogenia de la enteritis necrótica.

En este estudio, los pollos se vacunaron subcutáneamente con una toxina alfa recombinante a los 5 y 15 días de edad, y 10 días después se desafiaron con C. perfringens, agente causal de la enteritis necrótica. El desafío se administró dos veces al día durante 4 días consecutivos, mezclando los cultivos de la bacteria con el alimento.

El 87.8% de las aves desafiadas que no se habían vacunado desarrolló enteritis necrótica, pero sólo el 54.9% de las vacunadas desarrolló lesiones. Además, los testigos no vacunados presentaron calificaciones de lesiones que promediaron 2.37, en comparación con 1.35 en los pollos vacunados, de acuerdo con la publicación de K. K. Cooper et al. de la Universidad de Arizona en Tucson, EE.UU., en el número de junio de 2008 de la revista Veterinary Microbiology (Microbiología Veterinaria).

La vacunación también produjo una respuesta de anticuerpos, pues los títulos posvacunales contra la toxina alfa fueron más de 5 veces superiores que en los pollos no vacunados. Después del desafío, las aves vacunadas mostraron títulos promedio de IgG (IgY) más de 15 veces superiores a los de las aves no vacunadas, según explicaron los investigadores.

Ahora ha resurgido la enteritis necrótica en las aves de corral debido –en parte– a la prohibición del uso de los antibióticos promotores del crecimiento que se administraban en la ración, pero de acuerdo con los científicos, los resultados de este estudio sugieren que la toxina alfa se puede utilizar como un inmunógeno efectivo y, como tal, puede desempeñar un papel en la patogenia de la enteritis necrótica.

PRESCOTT: LA TOXINA ALFA ESTIMULA EXCELENTE PROTECCIÓN CONTRA LA ENTERITIS NECRÓTICA. PROBABLEMENTE ESTÉN INVOLUCRADAS TAMBIÉN OTRAS PROTEÍNAS

La investigación independiente realizada por científicos canadienses utilizando tecnología de vanguardia, confirma que la toxina alfa –una proteína que secreta Clostridium perfringens– desempeña un papel clave en el desarrollo de la enteritis necrótica en los pollos de engorde y que probablemente otras proteínas también participen en la patogenia de esta compleja enfermedad.

La inmunización con el toxoide alfa brindó protección casi total a los pollos productores de carne contra esta enfermedad, mientras que otras proteínas secretadas por C. perfringens virulento estimularon diversos grados de inmunidad, dijo el Dr. John F. Prescott, de la Universidad de Guelph, Ontario, Canadá, en una reunión de la Asociación de Veterinarios Especialistas en Aves de aquella localidad (OAPP), celebrada a principios del presente año en Guelph.

La enteritis necrótica se ha convertido en una enfermedad de importancia económica para la industria de los pollos de asar. Aun cuando se sabe que la causa es C. perfringens, no se conoce exactamente la manera como esta bacteria produce la enfermedad, explicó el Dr. Prescott.

Se ha culpado principalmente a toxina alfa; sin embargo, a principios del presente año algunos investigadores australianos publicaron un artículo sobre una nueva toxina de C. perfringens, a la que llamaron NetB. En muchas de las publicaciones de sus hallazgos, indicaron que esta toxina era la principal causa de la enteritis necrótica y, con base en sus cuidadosas investigaciones, descontaron el papel de la toxina alfa.

Estudio en Canadá

Sin embargo, las investigaciones realizadas por el Dr. Prescott y sus colegas muestran que la inmunización con la toxina alfa brindó la mejor protección contra el desafío severo con una cepa virulenta de C. perfringens que contenía el gen NetB.

En sus estudios, presentados por el mismo Dr. Prescott en la reunión de Ontario, evaluó varias proteínas secretadas por la citada bacteria y analizó su capacidad de proteger a los pollos contra la cepa virulenta. Estas proteínas fueron la toxina alfa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la piruvato:ferredoxín oxidorreductasa (PFOR), la fructosa 1,6-difosfato aldolasa, y una quinta proteína denominada hipotética (HP).

Los pollos se inmunizaron de dos a tres veces con una de estas proteínas y después de una semana de la última inmunización fueron desafiados con la cepa virulenta en el alimento, a las 4 semanas de edad.

Se presentaron diferencias en la severidad de los desafíos. Por ejemplo, un desafío suave consistió en la administración de la cepa virulenta en el alimento tres veces al día, durante 3 días, mientras que el más severo consistió en la administración de la cepa virulenta en la ración, continuamente durante 5 días. La severidad de cada desafío se confirmó mediante calificación de lesiones de enteritis necrótica en los testigos no inmunizados, desafiados.

Todas las proteínas protegieron significativamente a los pollos contra el desafío relativamente suave, pero cuando se administró el desafío severo, la protección significativa se obtuvo con la toxina alfa, la PFOR y la HP, reportó el investigador.

La toxina alfa brindó la mejor protección

Sin embargo, la mayor protección contra el desafío severo se presentó en las aves sensibilizadas previamente dos veces con el toxoide alfa (un toxoide es una toxina modificada de tal manera que pierde su toxicidad pero sigue siendo capaz de iniciar la inmunidad) y luego se reforzó con la toxina activa purificada. El Dr. Prescott y sus colaboradores reportaron lo anterior en el estudio publicado en el número de septiembre del año pasado de la revista Clinical and Vaccine Immunology (Inmunología Clínica y Vacunal).

Además, el suero y los lavados intestinales de las aves protegidas tuvieron títulos elevados de anticuerpos específicos contra todas las proteínas utilizadas en el estudio, de acuerdo con sus hallazgos.

Este fue el primer reporte en demostrar la capacidad inmunizante de las proteínas secretadas por C. perfringens contra la enteritis necrótica en pollo de engorde, de acuerdo con la publicación de Prescott et al.

Concluyeron que existen ciertas proteínas secretadas por la bacteria –además de la toxina alfa– que participan en la inmunidad de los pollos contra la enteritis necrótica.

La proteína NetB puede ser un marcador

El Dr. Prescott y su equipo también utilizaron la reacción en cadena con polimerasa (PCR) para probar a la cepa virulenta de desafío, encontrando que era positiva al gen NetB.

“El hecho de que la inmunización con la toxina alfa haya protegido poderosamente a las aves contra la enteritis necrótica experimental causada por un aislamiento que contenía a la proteína NetB, sugiere que la toxina alfa realmente es crítica para el desarrollo de esta enfermedad y que tal vez la proteína NetB sólo se encargue de iniciar la infección”, explicó.

“Sé bien que los investigadores australianos consideran que el éxito de los anticuerpos contra la toxina alfa en la magnífica protección contra la enteritis necrótica, se debe a que pueden interferir con la secreción de todas las proteínas de este microorganismo incluyendo –por ejemplo– la secreción de NetB. Tal vez esto sea difícil de demostrar, pero en realidad no importa, toda vez que la inmunización con la toxina alfa funciona tan bien”, agregó.

Además, algunas observaciones en Ontario, no publicadas, muestran que aislamientos no relacionados genéticamente y procedentes de pollos enfermos en parvadas con enteritis necrótica “sistemáticamente resultaron positivos a la proteína NetB, mientras que los aislamientos de aves sanas en el matadero por lo general resultaron negativas a la proteína NetB”, comentó.

“La gran mayoría –aunque no todos– los aislamientos [de C. perfringens] procedentes de aves con enteritis necrótica o de parvadas con esta enfermedad tiene la proteína NetB, por lo que constituye un buen marcador de las cepas de C. perfringens causantes de enteritis necrótica”, dijo el Dr. Prescott.

Cuando el reportero de la revista Intestinal Health (Salud Intestinal) le preguntó por qué se continúan realizando investigaciones con otras proteínas secretadas, cuando ya se ha demostrado que la toxina alfa puede proteger a los pollos de engorde contra la enteritis necrótica, el Dr. Prescott explicó que “será de gran ayuda para entender mejor a la enteritis necrótica, aunque estoy de acuerdo en que la toxina alfa debería ser el principal foco de atención. Con base en los hallazgos de protección de las aves después de la inmunización, la toxina alfa aparentemente desempeña un papel central en este padecimiento”, aunque el uso de más de una proteína puede aportar ventajas.

Agregó que las proteínas tienen diferentes actividades, incluyendo toxicidad, y también existen diferencias en sus blancos de acción.

A favor de la vacuna

Los métodos de control de la enteritis necrótica pueden incluir el uso de probióticos, para generar competencia bacteriana contra C. perfringens, o bien matar a esta bacteria con antibióticos nuevos, pero el Dr. Prescott está a favor de la inmunización.

“Creo que la vacuna probablemente sea el enfoque más promisorio, porque además será el más confiable. Me gusta la idea de aplicar una vacuna por vía oral, porque también se puede utilizar para administrar otros antígenos y productos”, dijo el orador, que además ha venido realizando experimentos con una vacuna oral atenuada de Salmonella, utilizándola como vector de antígenos de C. perfringens.

“Aun cuando todavía nos falta mucho por aprender sobre la enteritis necrótica, puedo prever un avance rápido en la tarea de dominar la enfermedad, gracias a la secuenciación del genoma a gran escala y a otras tecnologías. Debido a estos avances, los científicos que están trabajando en el mundo sobre enteritis necrótica han avanzado a pasos agigantados en los últimos 3 ó 4 años, en comparación con los 25 años anteriores”, dijo.

La enteritis necrótica es una enfermedad compleja

Encontrar maneras de prevenir o controlar la enteritis necrótica en los pollos de engorde no es tarea fácil, porque Clostridium perfringens –su bacteria causal– tiene características camaleónicas y, además, pueden estar involucrados otros factores como por ejemplo el manejo.

En el Congreso Avícola Mundial realizado el verano pasado en Brisbane, Australia, el Dr. John Prescott de la Universidad de Guelph, llamó a C. perfringens “un malhechor absoluto”.

Esta bacteria está “adaptada perfectamente, como anaerobio ambiental, para crecer muy rápidamente en los tejidos dañados o necrosados de los animales. Pensemos que Escherichia coli duplica su población cada 20 minutos. Por el contrario, C. perfringens es el microorganismo con el desarrollo más rápido conocido, pues bajo condiciones óptimas aumenta al doble cada 8 a 10 minutos”, comentó.

“Está diseñada de manera excelente para sacar ventaja del tejido dañado”, dijo. Secreta múltiples toxinas y enzimas para elevar al máximo la destrucción de los tejidos.

La Dra. Joan Schrader, científica de Intervet/Schering-Plough Animal Health, investigadora de la enteritis necrótica que ayudó a desarrollar Netvax, Toxoide de Clostridium perfringens Tipo A de la compañía para ser usada en pollos de engorde, está de acuerdo (véase su artículo en la página 7).

“El C. perfringens virulento cuenta con todo un arsenal de toxinas que puede producir y, dependiendo del ambiente en que se encuentre, las utilizará de la manera que le resulte más ventajoso dadas las circunstancias. Por ello, se trata en gran medida de una enfermedad multifactorial”, indicó.

La Dra. Schrader hizo eco a la opinión del Dr. Prescott de que “la toxina alfa es un factor clave, otras de las proteínas secretadas por C. perfringens pueden estar involucradas en el desarrollo de esta compleja enfermedad”, destacó.

Además, las proteínas secretadas por este germen pueden ser solamente una parte de la historia.

En la plática que presentó en la OAPP el Dr. Prescott citó una evidencia publicada de que los componentes de la dieta pueden afectar adversamente la motilidad intestinal o dañar su mucosa, lo cual a su vez afecta la producción de toxinas de C. perfringens o el crecimiento de este germen. La infección por coccidias también puede ser un factor contribuyente, aclaró.

“La interacción de [C. perfringens] con otros miembros de la flora intestinal –incluyendo a aislamientos no causantes de enteritis necrótica– y el efecto del resto de la microflora sobre la inmunidad intestinal innata, también pueden ser factores importantes”, dijo.

Tanto él como la Dra. Schrader dijeron que no cabe duda de que la enteritis necrótica es una enfermedad muy compleja.

El gen de la toxina alfa se viculv con la enteristis necrótica en India

Un estudio realizado con pollos de India confirmó que Clostridium perfringens tipo A era la causa de la enteritis necrótica y que la toxina alfa puede desempeñar un papel significativo en el desarrollo de esta enfermedad, dijeron Arunava Das y sus colaboradores del Instituto Tecnológico Bannari Amman.

Después de la muerte de seis pollos de engorde de 2 a 3 semanas de edad en una granja avícola de Meghalaya, India, los investigadores realizaron observaciones con microscopio electrónico de barrido, utilizando muestras de contenido intestinal e hígado.

Estos análisis revelaron necrosis masiva y destrucción completa de las vellosidades intestinales. El aislamiento bacteriano confirmó la presencia de C. perfringens como causante. Las pruebas de reacción en cadena con polimerasa (PCR) con 10 aislamientos clínicos mostraron la presencia del gen de la toxina alfa de C. perfringens , cuatro resultaron positivas al gen de la toxina beta 2 y ninguna a los genes de las toxinas beta, epsilon, iota o de la enterotoxina.

Todos los aislamientos derivados de casos de enteritis necrótica correspondieron a C. perfringens tipo A, observándose de 97.6 a 100% de homología entre los aislamientos de esta bacteria, según lo que publicaron en un reciente número del International Journal of Poultry Science (Revista Internacional de Ciencias Avícolas) (7 (6): 601-609, 2008).

Este estudio confirma que C. perfringens tipo A es el más prevalente, en asociación con la enteritis necrótica en los pollos de engorde en esta región de la India, y que el gen de la toxina alfa puede desempeñar un papel significativo en la patogenia de la enfermedad, en este tipo de aves, concluyeron los investigadores.

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